沙眼衣原体实验室检测二

继上次提到的四种方法，接下来介绍沙眼衣原体（chlamydiatrachomatis,CT）实验室检测的另外几种方法。

五、细胞培养法用于分离培养衣原体，敏感性70%~90%，特异性达99%，此法对技术和设备要求较高且费用昂贵，培养有一定难度，也可能出现假阴性。因此不适合大样本病例。

（一）鸡胚分离培养：卵黄囊培养对衣原体的早期分离功不可没，但阳性率低，自有细胞培养后，临床基本不再使用。

（二）细胞分离培养：单层细胞培养法CT是专性的细胞内寄生物，它只能在细胞中生长，Mc-Coy细胞（小鼠成纤维瘤细胞）提供了衣原体生长繁殖的必备条件，因此，常用它来进行培养和检测。传统的细胞培养法阴性标本盲传一代后仍为阴性，即确诊为阴性。然而有研究报道在一些有经验的实验室，增加传代培养的次数会明显提高沙眼衣原体泌尿生殖道感染的检出率。目前，单层细胞和培养基均有商品供应，虽费用较高，但很容易获得，另外常用的还有HeLa229细胞、BHK-21细胞、MCF-7，HaCaT细胞和HL细胞株等。细胞培养法一直是沙眼衣原体实验室检查的金标准，然而由于敏感性相对较低，不同实验室检出的阳性率差别较大，而且耗时、费钱，需要一定的实验设备，不适用于临床门诊中大量病人的实验室检查。

（三）衣原体微量快速培养法：很多学者对衣原体细胞培养方法做了改进，细胞培养由玻璃瓶改为试管，由试管改为微量快速的96孔板，同时也有改为适用于一般实验室的平皿法。

六、药敏试验日本化学疗法学会1992年建立的衣原体最低抑菌浓度测定方法是参照衣原体属国际通用的测定法而制定的标准法，在我国尚未建立衣原体的药敏试验标准法。

七、分子生物学方法：近年来随着分子生物学的飞速发展，许多分子生物学诊断方法相继出现，核酸杂交（核酸印迹法、斑点印迹法和组织原位杂交法等）特别是核酸扩增试验已不断用于衣原体的诊断。

（一）核酸杂交（nucleicacidhybridization）核酸杂交是最早用于衣原体诊断的分子生物学方法，其基本原理是具有一定同源性的二条核酸单链在一定条件下（适当的温度和离子浓度等）按碱基互补的原则形成双链。杂交过程高度特异，杂交的双方是探针和待检核酸，待检核酸是衣原体特异的基因或质粒DNA，探针用放射性同位素或非放射性物质标记，以利于信号的检测。根据CT染色体和质粒的DNA序列设计DNA探针。目前已有诊断衣原体的商品化探针试剂盒，它是利用标记有荧光素吖啶橙的单链DNA来检测靶衣原体中的rRNA。当形成一定的RNA-DNA复合物后，通过化学发光仪读出结果，敏感性和特异性分别为70%~92%和97%~98%。

（二）核酸扩增（nucleicacidamplification）核酸扩增试验是继核酸杂交试验之后又一个重要的检测手段。试验通过对特定对象（靶DNA）的扩增放大，使检测的敏感性大大提高。目前使用最广泛的是聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）。测定衣原体DNA，敏感性80%~92%，特异性99%（男性患者尿道标本和生殖道标本无差别，女性尿道标本的敏感性较阴道标本低）。用于诊断沙眼衣原体感染的PC法已有商品化试剂盒。PCR法诊断泌尿生殖道沙眼衣原体感染的敏感性高，在细胞培养阴性者亦能检测出沙眼衣原体感染。一种PCR（以质粒DNA顺序为引物）阳性而培养阴性的标本可以用另一种PCR（以不同的质粒DNA顺序或主要外膜蛋白基因顺序为引物）证实，说明可能并非是PCR假阳性结果。然而，也有报告由于残留（carryover）污染而造成PCR假阳性，或因标本中含有Taq酶抑制物质而使PCR假阴性。在PCR反应体系中加入内参照可以发现假阴性问题;此时可将标本以反复冻融几次或冻存较长时间或稀释等方法来解决之。临床上，PCR的结果应该结合病史和治疗情况进行分析，必要时重复取材或在另一部位取材作试验。沙眼衣原体核酸扩增技术的另一进展是可用清晨首次尿（或禁尿4h后的首次尿）作为标本。美国2015年性传播疾病诊疗指南中，沙眼衣原体的诊断唯一提到的方法就是核酸扩增试验（nucleicacidamplificationtest，NAATs），并且提到了清晨首次尿同样可以用于沙眼衣原体感染的诊断。由于尿液取材方便，对患者无侵害，因此这种方法适合于在不同人群中进行大规模筛查，也适合于边远地区标本采集后运送至中心实验室进行检测。PCR检测技术在衣原体感染中的应用前景是:①CT泌尿生殖道感染的早期诊断，尤其适用对无症状携带者或轻症患者的诊断;②作衣原体感染的分子流行病学调查，为性传播疾病的监测提供依据。

八、血清学检查人体感染衣原体后，产生相应抗衣原体抗体，检测这些特异性抗体可确定有无衣原体感染。检测血清抗体不同种类的临床意义也不尽相同:抗衣原体IgM抗体在成人生殖道感染并不常见;抗衣原体IgG抗体阳性率在性活跃人群高，尽管可以无活动性感染，既往感染足以引起阳性；而衣原体特异性血清IgA抗体则与疾病活动存在统计学相关性。

用于各型衣原体感染的血清学试验包括补体结合试验、微量免疫荧光试验、间接免疫荧光和酶免疫吸附试验等。微量免疫荧光试验和补体结合试验常用。血清学方法对诊断生殖道衣原体感染的合并症有意义。患输卵管炎或肝周围炎的女性或患附睾炎的男性患者血清抗体滴度非常高。此外，用酶免疫法测定衣原体抗体和微量免疫荧光法一样敏感，但不能用于新近感染。

血清学试验的诊断价值有局限性:①到目前为止还没有一种试验能完全适用于所有种类衣原体感染；②由于感染早期症状较轻微，往往错过急性期标本的采集时间；③由于血清抗体可持续很长时间，单一血清标本检测到的抗体只能说明以前感染过衣原体，只有当恢复期血清抗体与急性期抗体相比滴度有4倍增高并伴有临床症状时才支持目前有衣原体感染。由于敏感性、特异性、预测值不够理想，血清学检查不建议作为临床诊断疾病的活动性的手段。